חומרים אנטיויראליים ממקור טבעי

מצגת בנושא: "חומרים אנטיויראליים ממקור טבעי"— תמליל מצגת:

1 חומרים אנטיויראליים ממקור טבעי
פרויקט מחקר לתואר ראשון האוניברסיטה הפתוחה מגיש: גור סביליה בוצע בהנחיית פרופסור מיכאל עובדיה המחלקה לזואולוגיה, אוניברסיטת תל אביב יולי 2007

2 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
תולדות הרפואה: 3000 לפנה"ס - "אכול את השורש הזה" 100 לספירה - "התפלל על פי הפסוק הזה" 1650 לספירה - "שתה את השיקוי הזה" לספירה - "קח את הכדור הזה" 2000 לספירה - "אכול את השורש הזה"... חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

3 מטרת המחקר: שיטות וחומרים:
בידוד פרקציה פעילה נקייה ככל האפשר של חומר אנטיויראלי ממקור טבעי מסוים. שיטות וחומרים: נגיף השפעת Influenza A, זן H9N2. שיטות ביוכימיות: השקעה במלחים שונים וג'ל כרומטוגרפיה בוריאציות שונות. Assay Hemolysis. דיווח על מקרי שפעת במרץ 2007:

4 נגיף השפעת (Influenza) ידוע כמחולל מגיפות:
האפידימיולוגיה והביולוגיה של נגיף השפעת: נגיף השפעת (Influenza) ידוע כמחולל מגיפות: טיפוס משוער של הנגיף תמותה משוערת תאריך שם המגיפה H2N2 מיליון השפעת הרוסית H1N1 לפחות 20 מיליון השפעת הספרדית 1-1.5 מיליון השפעת האסיאתית H3N2 מיליון שפעת הונג קונג כל שנים מתפרצת מגיפה עקב שינוי גנטי גדול. השפעת הספרדית- הערכות ישנות מעידות על 40 מיליון, הערכות עדכניות מדברות על מיליון, כמו המוות השחור מגיפה זו הרגה 2-20% מהחולים, בניגוד ל- 0.1% במצב הרגיל של שפעת, רובם בגילאים של 20-40 איידס- 25 מיליון ב- 25 שנים הראשונות לקיומו במדע. כמות ההרוגים יורדת לא בגלל שינוי קטלניות הנגיף, אלא בזכות השימוש באנטיביוטיקה שמונעת זיהומים שיניוניים. 1 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

5 עונתיות במגיפת השפעת: הגרף מתייחס למקרי שעפת בארה"ב, סיבות לעונתיות- קור מחליש מערכת חיסונית, קור מאפשר שרידות גבוהה לנגיף מחוץ לגוף, חממת גידול בגני ילדים, נסיעות בחג המולד, ויטמין D, צפיפות במקומות סגורים. עונתיות גם בעופות! העברה בין עופות לאדם- חזירים. ההתפרצויות הינן עונתיות, ומתרחשות בעונה הקרה בכל המיספרה בכדור הארץ הנגיף גורם ל- 5 מיליון מקרי אשפוז בשנה בעולם, מתוכם 10% מתים.

6 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
Influenza- מבנה ותפקוד: נגיף RNA(-) ממשפחת ה- Orthomyxoviridae. ישנם שלושה סוגים של Influenza- A, B, C. ל- Influenza A קצב מוטציות מהיר. לזן B קצב מוטציות קטן פי 2-3 משל A. ישנה עדות לתקיפת כלבי ים על ידי זן B. הסוג נקבע על ידי חלבוני M ו- NP. הזן נקבע על ידי חלבוני HA, NA Influenza A & B תוקפים בעלי חיים נוספים מלבד האדם. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

7 Influenza- מבנה ותפקוד:
Hemagglutinin- לקטין הנקשר לשיירי חומצה סיאלית באפיתל מערכת הנשימה ביונקים ובעופות Neuraminidase- אנזים המאפשר את הנצת הויריונים על ידי פירוק החומצה הסיאלית שבממברנה

8 שני מנגנוני מוטציות אפידמיות עקב קצב מוטציות מהיר (1:104), Antignic Drift פנדמיות עקב רקומבינציה בין 8 המקטעים של הגנום, Antiginc Shift חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

9 תרופות הפועלות על ידי עיכוב תעלת היונים M2: Amantadine, Rimantadine
תרופות נגד שפעת תרופות הפועלות על ידי עיכוב תחרותי של Neuraminidase: Oseltamivir (Tamiflu) Zanamivir (Relenza)

10 חזרה למקורות - למה ומדוע או- אם אינך יכול להתחרות בהם, הצטרף אליהם...
רפואה עממית- IN רפואה מודרנית- OUT או- אם אינך יכול להתחרות בהם, הצטרף אליהם... שקופית הבאה- יתרונות רפואה עממית חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

11 ? אז למה רפואה עממית? חזרה לטבע בטיחות נגישות החומרים
פופולאריות, גישה ירוקה חמשת ה"גנים" (אלרגני, אימונוגני, טוקסיקוגני, קרצינוגני, פירוגני) נגישות החומרים ? חמשת הגנים- אלרגני, אימונוגני, טוקסיקוגני, קרצינוגני, פירוגני שקופית הבאה- מרק עוף עמידות בפני עמידות? תבלינים עממיים, צמחים מקומיים חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

12 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
שקופית הבאה- תהליך ההפרדה חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

13 איך עושים את זה? תהליך ההפרדה:
איך עושים את זה? תהליך ההפרדה: השקעה במלחים שונים KCl, (NH4)2SO4, TCA הפרדה כרומטוגרפית שקופית הבאה- salting in/out בדיקת בליעה אופטית ב- 280nm Hemolysis Assay חישוב יחידות פעילות ביחס לצפיפות האופטית חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

14 השקעה במלחים: Salting in & salting out
אשלגן כלורי אמוניום סולפט, AS חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

15 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
כרומטוגרפיה מגוון שיטת הפרדה על בסיס תכונות פיזיקליות ותכונות כימיות. פאזה נייחת גרגירית מחוררת. פאזה נעה הסוחפת עימה את החומר המופרד. ואריאציות ושיטות קרובות- ג'ל כרומטוגרפיה, כרומטוגרפית זיקה, RP, NP, מחליף יונים, שיטות אלקטרופורזה ועוד... חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

16 Hemolysis Assay: 1. הדגרת אריתרוציטים עם הנגיף- ספיחה (Attachment)
2. הורדת pH- הצמדות (Fusion) חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

17 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
שקופית הבאה- כיצד נראות תוצאות ההמוליזה חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

18 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
לאחר תהליך ההפרדה התוצאות מובאות על גבי גרף המשקף את יכולת הנטרול באחוזים של כל פרקציה. שקופית הבאה- תוצאות ראשוניות חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

19 ולבסוף מחשבים את הפעילות הספציפית:
מספר יחידות נטרול במ"ל (Units למ"ל), מחולק בערך הצפיפות האופטית למ"ל, ומקבלים את ערך הפעילות הספציפית ביחידות Units/OD יחידות פעילות Units / OD צפיפות אופטית חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

20 0.5 1.4 3 0.69 5.7 דוגמא לתוצאות השקעה התהליך נוזל עליון משקע
µl ל- unit OD ל- ml unit ל- OD OD ל -ml CE 20 100 0.5 ---- CE-AS(0.5M) 64 36 1.4 CE-AS(0.105M)-KCl(0.3M) 13 40 16.5 3 CE-TCA(0.25%) 72.5 0.69 10 17.5 5.7

21 דוגמא לתוצאות הפרדה כרומטוגרפית
התהליך µl ל- units OD ל- ml סיכום OD במבחנות הפיק units ל- OD Yield & Rerovery הפרדת 5cc CE->KCl 0.3M מושקע ב- AS 0.1M בג'ל ספדקס G75 40X250mm. 100 3.3 264.5 3.03 Units- 75% OD- 50% הפרדת 5cc CE->KCl 0.3M בג'ל ספדקס G75 40X250mm 50 4 80 5 Units- 40% OD- 14%

22 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
מנגנון הפעולה של חומר אנטיויראלי... חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

23 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
תוצאות: התוצאות מחולקת לשני חלקים: תוצאות ההשקעה במלחים השונים תוצאות ההפרדה בוריאציות שונות של כרומטוגרפיה מספר פרמטרים ניתנים עבור התהליכים השונים: פעילות ספציפית, כמתואר לעיל. Yield- כמות יחידות הנטרול בחומר המתקבל בסוף התהליך, לעומת כמות יחידות הנטרול שבחומר המוצא. המדד ניתן באחוזים. Recovery- כמות ה- OD שבחומר המתקבל בסוף התהליך לעומת כמות ה- OD שבחומר המוצא. המדד ניתן באחוזים. התוצאות המובאות להלן הינן הנבחרות מתוך רבות נוספות. פירוט רב יותר קיים בחוברת העבודה. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

24 חלק ראשון- תוצאות תהליכי השקעה במלחים
חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

25 תוצאות תהליכי ההשקעה במלחים שונים:
התהליך משקע µl ל- unit OD ל -ml unit ל- OD CE 20 100 0.5 CE(KCl M)1 X8 5 113.5 1.76 CE-KCl(0.3M)X8 1.7621 CE-AS(0-0.08M) 26 1.9231 CE-AS( M) 28 1.7857 CE-AS(0-0.5M) 36 1.3998 CE-Citrat(0-0.05M) 3.75 CE-Citrat( M) 19.5 2.5641 CE-Citrat( M) 2.3 CE-TCA(0.25%) 10 17.5 5.714 CE-TCA(0.5%) CE-TCA(1%) 2.5 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

26 אלו הן המסקנות העיקריות מניסויי ההשקעה:
השקעה ב- KCl הינה מיטבית בריכוז של 0.15M. השקעה ב- AS הינה מיטבית בריכוז 0.1M. השקעה בציטרט הינה מיטבית בריכוז 0.15M. השקעה ב- TCA הינה מיטבית בריכוז 0.25%. השקעה ב- TCA יעילה פי שתיים לערך מהשקעה בציטרט אשר מצידה יעילה פי שתיים, הן מהשקעה ב- KCl והן מהשקעה ב- AS. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

27 בניסוייים נוספים התגלה:
תוצר ההשקעה ב- TCA מאבד מפעילותו כעבור זמן. טיפול באוטוקלאב משפר את יעילות ההשקעה. כאשר מבצעים השקעה בשני מלחים שונים באופן טורי, יש חשיבות קלה לסדר ההשקעה. ניסויים אלו הינם ראשונים ובעלי תוצאות איכותיות בלבד, ולכן אינם מובאים בטבלה. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

28 חלק שני- תוצאות תהליכי הפרדה כרומטוגרפיים
חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

29 תוצאות תהליכי הכרומטוגרפיה השונים:
התהליך OD-Recovery Units Yield unit ל- OD הפרדת pool ניסוי 13 ב- DE23- משקע 29% 33% 1.9 הפרדת pool ניסוי 13 ב- DE23- נוזל עליון 19% 50% 4 הפרדת 29.5cc CE->KCl 0.3M X7 בקולונת ספדקס G75 40X250mm 44% 41% 1.62 5cc מ-pool ניסוי בקולונת DEAE23 2cc, פרקציות 2-3 של אילוציה ב- NaOH 0.1M, לאחר שבוצעה אילוציה במים 16% 0.982 500µl CE->KCl 0.3M X8 בקולונת DEAE23 2cc, פרקציה 4 של אילוציה מים 13% 0% 500µl CE->KCl 0.3M X8 בקולונת CMC23 2cc, פרקציה 4 של אילוציה מים 98% 50% (+) 0.833 (+) הפרדת 5cc CE מושקע ב- AS בקולונת ספדקס 40X250mm. התקבלו 16 פרקציות בנות 5cc בעלות כושר נטרול 75% 3.03 הפרדת 5cc CE->KCl 0.3M X8 בקולונת ספדקס G75 40X250mm שורה עליונה על פי 100μl, שורה תחתונה על פי 50μl 14% 40% 5 הפרדת 2.25cc CE->KCl 0.3M X8 בקולונת ספדקס G X30mm אילוציה ב- AN ובמים. שורה עליונה 2 מבחנות של ה- peak ראשון, שורה תחתונה 4 מבחנות של ה- peak שני 12% 36%.8 5.03 23% 71% 5.305 הפרדת CE->KCl 0.3M X8 בספרוז 6B 1.4X25cm, אילוציה במים, גלקטוז ו- AN. peak במבחנה 8 (אילוציה במים) 15% 6.58

30 פירוט המסקנות מניסויי ההפרדה הכרומטוגרפית:
הפרדת CE->KCl 0.3MX8 בספרוז 6B 1.4X25cm , אילוציה במים- בהפרדה זו נוצר Peak אחד של בליעה אופטית התואם Peak של יכולת נטרול. הפרדה זו מאופיינת ב- Yield של 40% עבור units, כלומר Yield בינוני, יחד עם ערך Recovery נמוך של 15% ל- OD. השילוב מעניק ערך גבוה של פעילות ספציפית , כלומר רמת ניקיון גבוהה. הפרדת CE->KCl 0.3MX8 בספדקס G75 100X3cm, אילוציה בAN ולאחריו מים- הפרדה זו מאופיינת בשני Peaks של בליעה אופטית ושני Peaks תואמים של יכולת נטרול. ה- Yield של ה- Peak הראשון נמוך משל השני, ונע סביב 30-40% מבחינת units, אך ערך ה- OD-Recovery הינו נמוך ועמד על 12%. בזכות הערך הנמוך של ה- OD-Recovery, מאופיין Peak זה בערך די גבוה של פעילות ספציפית ל- Peak השני ערך גבוה של Yield (71%), יחד עם ערך נמוך (אך גבוה משל ה- Peak הראשון) של OD-Recovery- סביב 20%. בזכות ה- Yield הגבוה של ה- Peak השני, מתקבל בו ערך גבוה של פעילות ספציפית- סביב 5.5. ניתן לדלג ישירות לשקף 32 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

31 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
הפרדת CE->KCl 0.3MX8 בספדקס G75 25X4cm, אילוציה במים- להפרדה זו Peak אחד בלבד. היא מאופיינת בערך בינוני של Yield 40%, יחד עם ערך נמוך של OD-Recovery 14%, ומכאן ערך גבוה של פעילות ספציפית- 5. הפרדת CE->AS 0.1 בספדקס G75 25X4cm, אילוציה במים- להפרדה זו Peak אחד בלבד. היא מאופיינת בערך גבוה של Yield 75%, יחד עם ערך בינוני של OD-Recovery 50%, ומכאן ערך בינוני של פעילות ספציפית- 3. הפרדת CE->KCl 0.3MX8 ב- CMC23 2cc, אילוציה במים- להפרדה זו Peak אחד המכיל למעשה את כל החומר שהוטען על הקולונה, כלומר אין ספיחה כלל למחליף קטיונים. הדבר נראה היטב בעין בלתי מזוינת, וכן בלט בתוצאות החישוב אשר הראו ערך פעילות ספציפית נמוך פי שתיים משל חומר המקור. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

32 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
הפרדת CE->KCl 0.3MX8 ב- DEAE23 2cc, אילוציה במים- להפרדה זו אין כלל Peak, לא מבחינת בליעה אופטית ולא מבחינת נטרול- כל החומר נספח חזק מאד לקולונה. הפרדת CE->KCl 0.3MX8 ב- DEAE23 2cc, אילוציה ב- NaOH M- להפרדה זו Peak אחד. היא מאופיינת בערך נמוך של Yield 16%, יחד עם ערך בינוני של OD-Recovery 44%, ומכאן ערך נמוך של פעילות ספציפית- 1. הפרדה זו מסובכת, שכן יש צורך לנטרל מיד את הפרקציות על ידי PB 0.5M, דבר הגורם לשקיעת החומר, ולמעשה מכל פרקציה היוצאת מהקולונה נוצרות שתי פרקציות לבדיקה- נוזל עליון ומשקע. עקב בעיית העמידות לאורך זמן של המנטרל בסביבה בסיסית, לא ניתן להשתמש בקולונה גדולה הגוררת עיכוב בזמן היציאה של החומר מהקולונה. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

33 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
הפרדת CE->KCl 0.3MX8, לאחר שהופרד בספדקס G75, ב- DEAE23 10cc, אילוציה ב- NaOH 0.1M- להפרדה זו Peak אחד, אך יש להתייחס בנפרד לנוזל העליון ולמשקע. הנוזל העליון מאופיין בערך בינוני של Yield 50%, יחד עם ערך נמוך של OD-Recovery 19%, ומכאן ערך גבוה של פעילות ספציפית- 4 (לתמיסת המקור ערך 2.26). המשקע מאופיין בערך נמוך של Yield 33%, יחד עם ערך מאד של OD-Recovery 29%, ומכאן ערך בינוני של פעילות ספציפית- לפחות 1.9 (לתמיסת המקור ערך 2.26). יש לציין שיתכן שמדידה מדויקת יותר של יכולת הנטרול במשקע יעלו את הפעילות הספציפית המחושבת לסביבות ה- 4. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

34 מסקנות סופיות לתהליכי הפרדה כרומטוגרפים:
הפרדת CE->KCl 0.3MX8 בספרוז 6B, אילוציה במים מעניקה ערך גבוה מאד של פעילות ספציפית, אולם חסרונה ב- Yield נמוך. הפרדת CE->AS בקולונת ספדקס G75 40X250mm מעניקה Yield גבוה במחיר פעילות ספציפית בינונית. הפרדת CE->KCl 0.3M X8 בקולונת ספדקס G X30mm אילוציה ב- AN ובמים מעניקה יחס מיטבי בין פעילות ספציפית לבין Yield, אולם דורשת שימוש בחומר נוסף, AN, דבר אשר מהווה חסרון בהפקת החומר. הפרדה בקולונת CMC אינה תורמת להפרדה, שכן אין כלל ספיחה של החומר הפרדה בקולונת DEAE מחייבת אילוציה בבסיס, ולכן מעוררת את בעיית עמידות החומר בסביבה בסיסית. אופן ההתגברות על הבעיה עדיין במחקר. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

35 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
מבט לעתיד: בהמשך המחקר הכוונה לנסות כיוונים כלהלן: אופטימיזציה של בידוד הפרקציה הפעילה על ידי וריאציות שונות של השקעה וג'ל כרומטוגרפיה. הפרדה בשיטות נוספות של כרומטוגרפיה ואלקטרופורזה. ניסיון להשיג "מיחזור" של החומר המנטרל, הן על קולונה והן כחומר חופשי,(משיקולים פרקטיים ולשם הבנת מנגנון הפעולה של המנטרל). ניסיון למיחזור נעשה עד כה, ללא הצלחה, בעזרת חימום, מלחים שונים, ממסים אורגניים. חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

36 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
תודה!!!! חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

37 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
להלן שקפי הרחבה קצרים בנושאים הבאים: השקעה במלחים- שורת Hofmeister ג'ל כרומטוגרפיה- אילוציה על פי גודל אפשרויות אילוציה בכרומטוגרפית זיקה NP/RP חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

38 חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי
שורת Hofmeister יונים קוסמוטרופים יונים כאוטרופים שקופית הבאה- כרומטוגרפיה חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

39 ג'ל כרומטוגרפיה- אילוציה על פי גודל:
שקופית הבאה- מגוון אפשרויות אילוציה חומרים אנטיויראלים ממקור טבעי

40 מגוון אפשרויות אילוציה בכרומטוגרפיה:
הידרופוביות עולה ריכוז מים יורד ריכוז מלח עולה (ריכוז מים יורד) מים 55.5M Acetonitril 100% NaOH 4M (בסיס/מלח) (מלח 0M) לגבי צד ימין של האילוציה- ככל הנראה מדובר בחוזק היוני שעולה, ולא בריכוז מלח כשלעצמו. מכיוון שלמעשה אין זו כרומטוגרפיה על פי גודל בלבד... הידרופובי.... הידרופילי....