ב. פלסמידים-Plasmids לרבים מן החיידקים יש DNA חוץ כרומוזומלי. DNA זה נקרא plasmid. ה DNA של פלסמיד הוא DNA מעגלי דוגדילי. לפלסמיד יש כושר הכפלה עצמי.

transformation - העברה של פלסמיד בין חיידקים. תהליך זה מתקיים בין חיידקים שיש להם את הפלסמיד לאלה שאין להם. מעבר של הפלסמיד עשוי לשנות את התכונות של החיידק המקבל. לדוגמא: במידה ויש ע"ג הפלסמיד גן לעמידות לאנטיביוטיקה גם החיידק המקבל ייהפך לעמיד לאנטיביוטיקה.

ג. אנזימי הגבלה -Restriction Enzymes. אנזימים שחותכים DNA. אנזימים אילו נתגלו לאחר שנמצא, שבמקרים מסוימים, לא ניתן היה להעביר תורשתי בין חיידקים. אנזימים אילו כנראה שייכים למנגנוני העמידות של החיידקים מפני תוקפנותם של נגיפים (bacteriophage) המחדירים את החומר התורשתי שלהם לחיידקים ופוגעים בהם.

המאפיינים של אנזימי ההגבלה Restriction enzymes)) קיימים מאות סוגים של אנזימים הגבלה. השוני בין האנזימים השונים בא לידי ביטוי: א. ברצף הנוקלאוטידים באתר החיתוך. ב. באופי החיתוך חיתוך ישר או מדורג. ג. במספר הבסיסים באתרי החיתוך 4,6 או 8. המשותף לכל אנזימי ההגבלה הוא, שיש להם אזורי החיתוך המתאפיינים ברצף נוקלאוטידים של פלינדרום.

חיתוך עם קצוות דביקים ((“sticky ends” . יתרונות השיטה: הווקטור פחות יכול להסגר על עצמו. שליטה על כיוון הכניסה של הפרגמנט.

חיתוך חלק ("blunt"). חסרונות: הווקטור יכול להסגר על עצמו. אין שליטה על כיוון כניסת הפרגמנט. יתרונות: פשוט יותר לביצוע. כל שני אנזימים שחותכים “blunt” יוצרים תוצרים תואמים.

השוואה בין תוצרי חיתוך של אנזימי חיתוך עם 4 ו 6 נוקלאוטידים באתר החיתוך. באנזים הגבלה, שאתר החיתוך שלו הוא 4 נוקלאוטידים, הסתברות לחיתוך תהיה אחת לכל 256 (44) נוקלאוטידים. באנזים הגבלה, שאתר החיתוך שלו הוא 6 נוקלאוטידים, הסתברות לחיתוך תהיה אחת לכל 4069 (46) נוקלאוטידים.

בהרצה במכשיר אלקטרופורזה...

עקרון ההפרדה בג'ל אלקטרופורזה. מקרא העצים- ג'ל. עכברים -מקטעי DNA קטנים. פילים- מקטעים גדולים של הDNA.

נקבל הפרדה ע"פ גודל של המקטעים. זיהוי המקטעים: א. בעזרת U.V.: לאחר ההרצה טובלים את הג'ל בחומר אשר נספח ל DNA ואשר זוהר תחת אור U.V.. ב. אוטורדיוגרפיה: קודם להרצה דואגים שה DNA יסומן בחומר רדיואקטיבי. סימון זה נעשה ע"י האיזוטופ P32. את הקרינה ניתן לזהות ע"ג נייר צילום.

מפת אנזימי ההגבלה. ניתן להפעיל על אותו מקטע של DNA מספר אנזימי חיתוך שונים. לאחר מכן להריץ את הדגימות השונות באלקטרופורזה. זיהוי מקטעי ההרצה יעשה ע"פ אחת השיטות שצויינו לעיל (U.V. וע"י אוטורדיוגרפיה). בעקבות ניתוח של סדרת המקטעים ניתן לשרטט את מפת ההגבלה של הקטע לאותם האנזימים.

ד. DNA רקומביננטי (Recombinant DNA) . הגדרה : DNA רקומביננטי הוא DNA ייחודי, שנוצר ע"י חיבור של שני מקטעים שאינם מצורפים יחדיו באופן טבעי. יצירת הDNA הרקומביננטי. חיתוך שני מקטעים ע"י אותו אנזים חיתוך. חיבור של המקטעים (תהליך זה מתבצע בטמפרטורות נמוכות). איחוי של שני הגדילים בעזרת אנזים ליגאז.

בשיטה זו ניתן להחדיר מקטעי DNA לפלסמיד, ובכך להפוך את הפלסמיד ל DNA רקומביננטי.

הפלסמיד כמולקולת נשא. לפלסמיד תכונות שונות המכשירות אותו לשמש כנשא של DNA (כווקטור) זר לחיידק: משקל מולקולרי נמוך (בד"כ עד kb 10) המקנות לו יציבות. מולקולה זו עמידה בפני שבירה בעת הטיפול. בשל צורתו המעגלית קל הפריד אותה מיתר מקטעי הכרומוזומים. הפלסמיד הוא בעל כושר הכפלה עצמי. לפלסמיד יש סימני ברירה (עמידות לאנטיביוטיקה) שבעזרתם ניתן לברור בין התאים שקלטו פלסמיד לבין אלה שלא קלטו אותו. יש על הפלסמיד אתרי חיתוך למספר אנזימי הגבלה.

ה. שיבוט גנים בחיידקים. בתהליך השיבוט יוצרים אוכלוסיית תאים עם ה DNA הרקומביננטי. בידוד מקטע ה-DNA הרצוי. חיבור (ליגציה) של מקטע זה למולקולת נשא (vector) – קבלת מולקולה רקומביננטית. טרנספורמציה – החדרת המולקולה הרקומביננטית לתאי פונדקאי. סלקציה של התאים הרקומביננטיים בעזרת אנטיביוטיקה. יצירת השבט (clone) – ה DNA הרקומביננטי משתכפל בתוך תא הפונדקאי. כאשר תא הפונדקאי מתרבה, מועברים עותקים של המולקולה הרקומביננטית לצאצאים. בתום סדרה של חלוקות תא, מתקבל שבט (clone) של תאי פונדקאי זהים. כל תא בשבט מכיל לפחות עותק אחד של הDNA הרקומביננטי.

סימני הברירה בפלסמיד pBR322. לפלסמיד זה שני גנים המקנים לעמידות לשני סוגי אנטיביוטיקה ampicillin ו tetracyclin. ה DNA הזר הוחדר באתר החיתוך Sall. הפלסמיד הוחדר לחיידקים (טרנפורמציה). חיידקים שקיבלו את הפלסמיד ללא ה DNA הזר היו עמידים לשני סוגי האנטיביוטיקה. חיידקים שקיבלו את הפלסמיד עם ה DNA הזר היו עמידים כנגד ampicillin ולא נגד tetracyclin.

סימני הברירה בפלסמיד pUC18. לפלסמיד שני גנים. אחד המקנה עמידות כנגד האנטיביוטיקה ampicillin והשני lacZ המקודד לאנזים המפרק חומר חסר צבע -x-gal לתוצר עם צבע כחול. ה DNA הזר הוחדר באתר החיתוך Xbal. הפלסמיד הוחדר לחיידקים (טרנפורמציה). כל החיידקים שקיבלו את הפלסמיד התפתחו בצלחת עם האנטיביוטיקה ampicillin . חיידקים בהם נמצאו הפלסמידים עם הDNA הזר פתחו מושבות לבנות. בעוד אלה שלא שולב בהם הDNA הזר פיתחו מושבות כחולות.

פרוק סובסטרט זה ע"י האנזים lacZ מקנה צבע כחול למושבה. תוצאות הזריעה בצלחת המכילה ampicillin וסובסטרט X-gal (bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside). פרוק סובסטרט זה ע"י האנזים lacZ מקנה צבע כחול למושבה. חיידקים עם פלסמיד רקומביננטי חיידקים ללא פלסמיד רקומביננטי

זיהוי גן בעזרת תוצר גם לאחר שמוצאים את החיידקים שקיבלו את הפלסמיד הרקומביננטי, יש עוד מקום לבדוק האם הגן מתבטא בחיידק? תהליך זה יכול להיעשות ע"י זיהוי התוצרים. תיאור השיטה: יוצרים הדפס של המושבות ע"ג נייר ניטורצולוז. החלבונים נספחים לנייר. מדגירים את הנייר עם נוגדן כנגד החלבון. שטיפה. מדגירים עם נוגדן שניוני מסומן רדיואקטיבית. בדיקה באוטורדיוגרפיה.