ProteinLab מעבדה ממוחשבת לניקוי חלבונים

ProteinLab - הקדמה תוכנה זו נכתבה באוניברסיטת לידס ניתנת להורדה כאן, וניתן בעזרתה לתרגל ניקוי חלבונים התוכנה מכילה קובץ נתונים המדמה תערובת של 20 חלבונים (מזוהים במספרים סידוריים) עבור כל חלבון ידועים מס' נתונים בסיסיים. עליכם לבחור את שיטות הניקוי היעילות ביותר כך שהחלבון ינוקה בצורה אופטימלית אזהרה: אי יעילות עלולה לשמש עילה לפיטוריכם! 

ProteinLab – ההתחלה... לאחר הקלקה כפולה על אייקון התוכנה , יופיע מסך הפתיחה. Begin Start from Beginning לאחר מכן יופיע החלון הבא: בוחרים: לא החלבון שעליכם לנקות (מתוך 20 החלבונים שבמאגר) הוא סכום שתי ספרות הביקורת בתעודות הזהות של שני בני הזוג. הקישו את מספרו. לאחר שבחרתם, תופיע תיבת טקסט ובה מס' נתונים בסיסיים על החלבון. יש להעתיק נתונים אלו למחברתכם מאחר שהם לא יופיעו יותר! עליכם להיעזר בנתונים התחלתיים אלו לצורך ניקוי החלבון

(הקליקו על השורות המוארות כדי לקבל מסך לדוגמה) לדבר על דו"ח התקדמות + ועל תפריט fractions (הקליקו על השורות המוארות כדי לקבל מסך לדוגמה)

ProteinLab – פירוט שיטות ההפרדה Ammonium Sulphate שיטה המבוססת על עיקרון salting out : ריכוז מלח עולה מסיסות חלבון יורדת יש לבחור את אחוז ההשקעה ולאשר. התוכנה תחשב את פעילות האנזים וכמות החלבון במשקע ובנוזל העליון שהתקבל על פי התוצאות, יש לבחור האם רוצים להמשיך את הניקוי עם הנוזל העליון או עם המשקע כדאי לנסות הפרדות באחוזי Amm. Sulphate שונים עד למציאת התנאים הטובים ביותר להפרדה

Heat denaturation יש לבחור את הטמפרטורה ואת משך הזמן שבו החלבונים יעברו דנטורציה יש לשמור על תנאים בהם תשמר פעילות האנזים לפי האינפורמציה ההתחלתית שקבלת על האנזים

Gel filtartion הפרדה המבוססת על הבדלים בגודל תת היחידות של החלבון ככל החלבון קטן יותר, הוא יתעכב יותר בקולונה ויצא בפרקציות המאוחרות יותר. לקולונות שונות יש יכולות רזולוציה שונות (לחיצה על “info” תיתן את הרזולוציות עבור הקולונות השונות)

Gel filtartion המשך לאחר בחירת הקולונה הרצויה, תקבל גרף של הפרקציות שהתקבלו כתוצאה מההפרדה בקולונה

בדיקה ואיסוף הפרקציות האפשרויות המופיעות בתפריט Fraction: Assay enzyme activity– מראה מי מבין כל הפרקציות מכילה את החלבון הרצוי Dilute fractions – במידה ולא רואים את הקצה של אחד הפיקים, יש להשתמש באפשרות זו כדי למהול את המקטעים (לזכור שמהילת יתר עלולה לפגוע בפעילות האנזים המבוקש) Pool fractions – איסוף הפרקציות: יש לסמן בעזרת העכבר את גבולות הפרקציה שרוצים לאסוף חשוב: אחרי שמסמנים לא ניתן לבטל את הפעולה, אלא חייבים להתחיל הכל מההתחלה !

Ion exchange chromatography שיטת הפרדה המבוססת על מטען החשמלי של המולקולות ניתן להשתמש ב 4 קולונות: קולונות הספרוז טעונות בטווח רחב יותר של PH מקולונות הצלולוז לאחר שבחרתם קולונה, יש לבחור את ה PH של בופר שיווי המשקל. לאחר מכן מתכננים את הריכוז העולה של גרדיאנט המלח. (שטיפה- ריכוז נמוך, אילוציה- ריכוז גבוה) מתקבל גרף המתאר את הפרקציות שהתקבלו. בדוק פעילות אנזים בפרקציות ואסוף את הפרקציה הפעילה ביותר. סוג הקולונה סוג המטען DEAE Cell. + .CM Cell. - Q Sepharose S Sepharose ספרוז טוב יותר מצלולוז

Hydrophobic interaction chromatography ניתן לבחור בין 2 קולונות: Phenyl Seph - משמשת להפרדת חלבונים מאוד הידרופוביים Octyl Seph - משמשת להפרדת חלבונים פחות הידרופוביים לאחר שבחרתם קולונה, עליכם לבחור את טווח גרדיאנט המלח להפרדה ריכוז התחלתי גבוה אשר מגביר את קשירת החלבון לקולונה האילוציה מתבצעת בריכוז מלח נמוך אשר מגביר את מסיסות החלבון והתנתקותו מהקולונה גם כאן מתקבל גרף המתאר את הפרקציות שהתקבלו; יש לאסוף את הפרקציה הפעילה ביותר הפדה מבוססת על הבדלים בקבוצות ההירופוביות/פיליות בחלבונים שונים

Affinity Chromatography Isoelectric focusing יש לבחור את טווח ה PH להפרדה (אין נתונים מראש) לאחר שמתקבל גרף ההפרדה, יש לאסוף את הפרקציה הטובה ביותר Affinity Chromatography מפריד את האנזים המבוקש על בסיס אינטראקציה ספציפית של אנזים סובסטרט או רצפטור-ליגנד. אפשרות זו זמינה רק בחלק קטן מהחלבונים הפרדה מבוססת על הבדלים ב PI של חלבונים שונים

ולא לשכוח... לכל פעולה יש מחיר, והתוכנה נותנת הערכה שלו. ה- cost מבטא שני מרכיבים עיקריים- עלות הריאגנטים והציוד, ומשך הזמן שהפעולה לוקחת. מובן שעדיף קודם לנצל את הפעולות שעלותן נמוכה (דנטורציה בחום, השקעה באמוניום סולפט) מאשר להתחיל באלו שעלותן גבוהה. ככלל, 2-3 פעולות זולות יעלות לרוב מפעולה אחת יקרה.

ProteinLab – הסוף... תרגיל להגשה (עבודה בזוגות): סכמו בקצרה את שיטות ההפרדה הנזכרות בתוכנה כל זוג יקבל חלבון להפרדה. עליכם להעשיר את החלבון פי 15 לפחות תוך שימוש ב-4 או יותר שיטות הפרדה יש להגיש את דו"ח ההתקדמות שהתוכנה יצרה מלווה בדיון תמציתי (אילו פעולות היו יעילות, ואילו היו מיותרות). בצעו את ההוראות הנ"ל ביחס לחלבון הנוסף שקיבלתם. השוו בין שני החלבונים שלכם, והסיקו מסקנות ביחס אליהם (PI, משקל מולקולרי, טמפרטורה, יציבות ל-pH, הידרופוביות). המצגת זמינה באתר הקורס.

ועוד כמה מילים טכניות בכל שלב ניתן לראות את דו"ח הפעילות שלכם על ידי הקשה על : Help progress report כל עוד לא סיימתם את פעולת הניקוי הנוכחית תוכלו לבטלה על ידי: Quit Abandon this step and continue כדי לצאת מהתוכנה ולהתחיל מהתחלה: Quit Abandon scheme and start again

חשוב ביותר !!!! בכל שלב כתבו במחברתכם את נתוני הפעולה שביצעתם. התוכנה אינה שומרת את הנתונים הללו, אלא רק את התוצאות שהתקבלו מהם. את הדו"ח שהתוכנה נותנת "צלמו" בעזרת מקש “print screen” שבמקלדת, והדבקתו בתוכנת paint שב- PC, משם תוכלו לגזור את החלקים הרלוונטיים.

THE END

Progress Report

על מנת לזהות את האנזים המבוקש : 2-Dimensional PAGE על מנת לזהות את האנזים המבוקש : Stain Immunoblot