מבוא לביואינפורמטיקה יואלה יריב רוברט בצאם 17.june.2002

מבוא נבנו ספריות הפחתה של cDNA לקבלת גנים הנבדלים בביטויים בשלבים שונים של הבשלת פרי (צעיר / בוגר).

מבוא : חלוקת הפחתה כללי : טכניקה זו מאפשרת לבצע הפחתה של גנים כלומר סילוק של גנים שהתבטאו במשותף בשתי רקמות שנערכת בינהן השוואה. הטכניקה משאירה רק את הגנים שהתבטאו ברקמה אחת ולא בשניה וכך ממקדת את העבודה בגנים הנבדלים בביטויים. א. מפיקים את כלל ה-mRna משתי רקמות שנערכת בינהן השוואה. ב. שתי אוכלוסיות ה-mRna מומרות ל- cDna. ג. מוסיפים Adaptor-ים לקצוות אוכלוסיית ה- Tester, היא האוכלוסייה שבה אנו מחפשים את הגנים הדיפרנציאליים (פרי בשל). ד. ה- cDna-ים משתי האוכלוסיות עוברים היברידיזציה.

מבוא : חלוקת הפחתה (המשך) ה. מה שעבר היברדיזציה מסולק. ו. ה- cDna-ים הנותרים מייצגים גנים שמבוטאים באוכלוסיה אחת אבל חסרים בשניה. ז. בעזרת האדפטורים יוכפלו ב-PCR רק רצפי הטסטר שהתבטאו דיפרנציאלית. ח. ה- cDna-ים הללו מוחדרים לוקטורים (פלזמידים) ליצירת ספריה. קישורים : http://www.clontech.com/pcr-select/indextest.shtml

מבוא (המשך) נמצאו גנים שהתבטאו דיפרנציאלית בשלב הבשלה מסוים של הפרי.

תיאור הבעיה מציאת בסיס חישובי להתבטאות הדיפרנציאלית של הגנים. מציאת קשר פונקציונלי (תיפקודי) בין גנים שמקורם באותה ספריה (לכן מציגים פרופיל ביטוי משותף) או בין גנים המושפעים מאותו גורם בקרה. נרצה למצוא אם הגנים פועלים במסלול ביוכימי משותף. מציאת רמזים לתפקידם של גנים בלתי ידועים.

דרכי פתרון הבעיה ננסה לפתור את הבעיה בשני מישורים : 1. זיהוי מוטיבי בקרה משותפים. 2. בעזרת מסלול ביוכימי משוער.

זיהוי מוטיבי בקרה משותפים – א' בחירת הגנים : נבחר קבוצת cDNA שמקורם באותה ספריה ולכן יש להם פרופיל ביטוי משותף. דרכי פעולה : נרחיב את קטעי ה-cDNA לגנים שלמים באמצעות Blast תוך הסתמכות על דמיון גבוה לצמח Arabidopsis או לעגבניה. נמצא מוטיבים משותפים לכל הגנים, באמצעות MEME. נחקור את משמעות המוטיבים ע"י חיפוש במאגרי מידע של מוטיבים ידועים ( באמצעות MAST או Transfac ). נמצא גנים ידועים המכילים מוטיבים אלה. מתוכם נשווה מול גנים בעלי תפקיד ידוע שמקורם באורגניזם/רקמה דומה.

זיהוי מוטיבי בקרה משותפים – ב' בחירת הגנים : נבחר קבוצת cDNA -ים המבוקרים על-ידי גורם משותף. רקע : אתילן הוא בעל תפקיד מפתח בבקרה של הבשלת פרי, הוכח כי האתילן מעורר הבשלת פרי. ידוע מסלול ביוכימי ליצור אתילן. אי תפקוד של אחד האנזימים במסלול מונע הבשלת הפרי. הוכח ניסויית כי קיימים גנים (שתפקידם אינו ידוע) המבוקרים ע"י אתילן (לדוגמה Mel 7).

זיהוי מוטיבי בקרה משותפים – ב' (המשך) דרכי פעולה : ניקח cDna – ים מהספריה אשר אינם חלק מהמסלול הביוכימי של יצור אתילן ושרמת ביטויים מושפעת מאתילן . נרחיב את מנין הרצפים ע"י גנים נוספים מהספרות המושפעים מאתילן. מאחר והאתילן מבקר את כולם נרצה לדעת האם קיימים מוטיבי בקרה משותפים. נחפש מוטיבים משותפים לכלל הגנים בעזרת MEME. נחקור את משמעות המוטיבים ע"י חיפוש מול מאגרי מידע של מוטיבים ידועים ( באמצעות MAST או Transfac ). נמצא גנים ידועים המכילים מוטיבים אלה. מתוכם נשווה מול גנים בעלי תפקיד ידוע שמקורם באורגניזם/רקמה דומה. ננסה להסיק על משמעות גן שתפקידו לא ידוע (Mel 7) .

זיהוי תפקיד בעזרת מסלול ביוכימי משוער בחירת גנים : נבחר cDNA שמקורו בספריה של פרי בשל ותפקידו לא ידוע ( (Mel7. רקע : בבדיקת ביטויו ברקמות צמחיות שונות נמצא כי מתבטא בפרי בשל בלבד. בבדיקת עוצמת ביטויו בספריות, נמצא כי הופיע במספר רב של עותקים (158) בספרית הפרי הבשל ולא נמצא כלל בספרית הפרי הצעיר. דרכי פעולה : חיפוש דמיון לחלבונים בעזרת BLAST . הצלבה עם מידע ניסויי מהספרות במטרה לחפש דמיון לחלבון שיתן רמז לפעילות במסלול ביוכימי ידוע. נחפש דמיון (הומולוגיה) למרכיבי המסלול הידועים. נחפש דמיון למרכיבי המסלול החסרים דרך הבנת פעילותם וחיפוש במאגרי מידע אחר חלבונים עם תפקיד דומה. מכאן ננסה להסיק על תפקידו של הגן (Mel7) שהציג ביטוי דיפרנציאלי גבוה בפרי.

סוף